2020主管检验技师《微生物与寄生虫》知识点：细菌对药物的敏感试验

第三十章　细菌对药物的敏感试验

　　扩散法(K-B法)

　　稀释法

　　杀菌试验

　　体外联合药物敏感试验

　　厌氧菌、结核分枝杆菌及酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验

　　体内抗菌药物的活性与浓度测定

　　三、细菌的耐药性和产生机制

　　细菌耐药的机制

　　细菌耐药性表型的检测

　　药敏试验中抗菌药物的选用

　　原则：

　　·按临床需要选用抗菌药物的种类

　　·同类抗菌药物仅选一个作为代表

　　·根据测定细菌的种属和感染部位进行选药

　　1.青霉素类：青霉素与青霉素结合蛋白(PBP)结合，抑制细菌细胞壁合成。

　　作用于不产青霉素酶的革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌;产青霉素酶的葡萄球菌;大部分大肠埃希菌、奇异变形杆菌、流感嗜血杆菌等革兰阴性杆菌;产β-内酰胺酶肠杆菌科细菌和假单胞菌等。

　　2.头孢菌素类：头孢菌素与青霉素结合蛋白结合，发挥抑菌和杀菌效果。

　　随着代次增加对于革兰阳性球菌的抗菌效果减弱，对革兰阴性杆菌的作用增强。第四代头孢菌素对阳性球菌与阴性杆菌作用几乎相同，并具有抗假单胞菌的作用。

　　3.其他β-内酰胺类

　　(1)单环类：氨曲南等。对G-菌作用强，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌。对G+和厌氧菌无作用。

　　(2)拉氧头孢类：对G+菌有较好的抗菌活性，对厌氧菌有高度抗菌活性，但对非发酵菌无效。

　　(3)碳青霉素类：除了嗜麦芽窄食单胞菌、耐甲氧西林葡萄球菌、尿肠球菌和某些脆弱类杆菌耐药外，对几乎所用的由质粒或染色体介导的β-内酰胺稳定。

　　(4)β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂：与β-内酰胺类抗菌药物联用能增强后者的抗菌活性，如克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。

　　4.氨基苷类：吸附作用造成膜的损伤;核糖体30S小亚基。

　　氨基苷类抗菌药物对需氧革兰阴性杆菌有较强的抗菌活性，对阳性球菌有一定的活性。

　　5.喹诺酮类：通过外膜空蛋白和磷脂渗透进入细菌细胞;作用于DNA旋转酶，干扰细菌DNA合成。

　　第二代喹诺酮类对革兰阴性和阳性细菌均有作用;

　　第三代喹诺酮类对革兰阳性菌作用高于第二代的4～8倍，对厌氧菌亦有作用。

　　6.大环内酯类：细菌核糖体50S大亚基;肺部浓度较血清浓度高;新一代具有免疫调节功能。

　　对流感嗜血杆菌、军团菌、支原体、衣原体等具有强大的抗菌作用。

　　细菌对药物的敏感试验

　　细菌对抗菌药物的敏感试验(药敏试验)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验。主要用于：

　　①选择效果最佳的药物治疗;

　　②了解耐药性变迁;

　　③某些细菌的鉴定;

　　④流行耐药菌的防治。

　　扩散法(K-B法)

　　纸片琼脂扩散法：半定量;标准方法。

　　·原理

　　将含有定量抗菌药物的纸片(药敏纸片)贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

　　抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

　　·方法

　　1.培养基：水解酪蛋白(Mueller-Hinton，M-H)琼脂;链球菌属等细菌须在M-H琼脂中加入5%的脱纤维羊血。嗜血杆菌属细菌需补充1%血红蛋白(含V因子)和1%X因子复合物。

　　2.抗菌药物纸片：专用药敏纸片;纸片应贴得均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。

　　3.菌液：以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液，并在管壁上拧压一次，均匀涂布接种于M-H琼脂表面，涂布三次。

　　4.培养平板室温放置15min再倒放于35℃培养16～18h后阅读结果。

　　·结果判读：

　　敏感(S)：常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。

　　中介度(I)

　　耐药(R)：常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制检测菌生长。

　　稀释法：定量

　　·原理

　　根据稀释培养基的不同，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。琼脂稀释法是细菌药敏试验的金标准。肉汤稀释法是以水解酪蛋白(M-H)液体培养基将抗菌药作不同浓度的稀释，然后接种待测菌。

　　稀释法所测得的某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度为最低(或最小)抑菌浓度(MIC)，稀释法也可测定最小杀菌浓度(MBC)。

　　·方法

　　1.抗菌药物原液的配制：配制各种抗菌药物原液的溶剂。

　　2.培养基：一般细菌采用M-H液体培养基。

　　3.排列试管10～15支，除第一支外，每管加入M-H液体培养基1ml;再加入浓度梯度的抗菌药物。另设培养液对照，检测菌生长对照和质控菌生长对照管各一支。

　　4.将已校正浓度的待测菌悬液依次加入含药管内，置35℃培养后观察结果。

　　·结果判读：

　　凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该待测菌最低抑菌浓度(MIC)。

　　MIC测定法的实验结果

　　从左起第四管为药物最低浓度而无细菌生长，即待检菌的MIC。

　　杀菌试验

　　定量评价抗菌药物杀菌效力的试验，主要包括最低杀菌浓度(MBC)试验和杀菌曲线法。

　　1.最低杀菌浓度：某抗菌药物能杀灭99.9%以上的测试菌量的最低药物浓度。测定方法就是稀释法MIC测定的基础上通过再转种、再孵育，最终测得某种抗菌药物对被测菌的MBC。

　　2.时间-杀菌曲线：评价一种抗菌药物对测试菌的杀菌速率，以及两种或两种以上抗菌药物对测试菌的联合杀菌活性。测定MIC的肉汤稀释法相同，设定0h、4h、8h、24h等不同培养时间的试验管，将各时间点测得的平均菌落计数在半对数坐标纸上绘制杀菌曲线。

　　体外联合药物敏感试验

　　·联合抑菌试验：首先分别测定拟联合的抗菌药物，如A药和B药对被测菌的MIC，根据A药和B药的MIC确定药物联合测定的稀释度。

　　·联合杀菌试验：分别测定并绘出两种药物对被测菌的单独杀菌曲线和联合后的杀菌曲线，根据杀菌曲线判断联合用药的结果。

　　厌氧菌、结核分枝杆菌及酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验

　　·1.厌氧菌：稀释法、E-test试验

　　·2.结核分枝杆菌

　　结核分枝杆菌和缓慢生长分枝杆菌：主要有比例法、绝对浓度法和耐药率法。每种方法又分直接法和间接法。

　　快速生长分枝杆菌：肉汤稀释法和琼脂纸片洗脱法。

　　·3.真菌：肉汤稀释法和琼脂纸片洗脱法。

　　体内抗菌药物的活性与浓度测定

　　·浓度测定

　　1.微生物测定法　分为比浊法、试管稀释法和琼脂扩散法。

　　2.非微生物法

　　(1)荧光偏振免疫测定。

　　(2)高压液相层析法。

　　(3)均相免疫测定法。

　　(4)放射免疫测定法。

　　·活性测定：有血清抑菌力和杀菌力测定，其原理与肉汤稀释法测MIC，以及MBC的原理类同。

　　细菌耐药性和产生机制

　　细菌耐药的机制

　　·产β-内酰胺酶

　　·产生钝化酶

　　·青霉素结合蛋白的改变

　　·药敏作用靶位的改变

　　·抗菌药物渗透障碍

　　(1)外膜蛋白减少

　　(2)药物外排作用

　　细菌耐药性表型的检测

　　·超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)

　　常见于肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌。可以水解青霉素一、二、三代头孢菌素和氨曲南，但头霉菌素和碳青霉烯类不受影响。

　　K-B法筛查

　　所有产ESBLs的菌株应当报告为耐所有青霉素类、头孢菌素类及氨曲南。

　　·葡萄球菌属

　　MRS对甲氧西林的耐药是异常PBPs所致。呈现多重耐药性。

　　琼脂稀释法：含4%NaCl，6μg/ml苯唑西林的MH琼脂。

　　头孢西丁纸片法或稀释法。

　　MRS对头孢菌素和复合性β内酰胺类可在体外显示活性但临床无效，因此不应报告敏感。

　　·肠球菌属

　　对氨基糖苷类呈耐药性的肠球菌(HLAR)的测定：用高浓度庆大霉素或链霉素进行耐药筛选(纸片扩散法、稀释法)。

　　耐万古霉素的肠球菌(VRE)获得性耐药分两种表型，VanA和VanB，天然耐药为VanC型。(琼脂筛选法：脑心浸液琼脂+万古霉素6μg/ml)。

　　对于肠球菌属，头孢菌素、氨基糖苷类(筛选高水平耐药除外)、克林霉素和磺胺类可在体外显示活性，但临床无效，不应报告敏感。

　　·肺炎链球菌

　　对β-内酰胺类的耐药是由于PBP的改变。

　　1μg苯唑西林的纸片筛选法。

　　·产AmpC酶的革兰阴性杆菌

　　主要由肠杆菌属、弗劳地枸橼酸盐杆菌、摩根菌、黏质沙雷菌、铜绿假单胞菌产生，由染色体介导。

　　对青霉素、舒普深、三代头孢及氨曲南耐药，对亚胺培南及四代头孢菌素敏感。

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