杂交瘤技术的基本原理
一、杂交瘤技术
(一)小鼠骨髓瘤细胞
1.细胞株稳定,易于传代培养。
2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷株。
4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。
(二)免疫脾细胞
选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠,鼠龄8~12周,体重约20g,雌雄均可,但必须分笼。免疫用抗原尽量提高其纯度和活性,多用腹腔内或皮内多点注射法。如微量抗原,可脾脏内直接注射进行免疫。
(三)细胞融合
PEG(聚乙二醇)有助于细胞融合。
(四)杂交瘤细胞的选择性培养
将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。
1.脾细胞:在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞:采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞,在HAT培养基中不能增殖。
3.杂交瘤细胞:骨髓瘤细胞与脾细胞融合,获得HGPRT,可以利用次黄嘌呤合成DNA,故可以存活。
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
单个细胞培养又称克隆化。细胞克隆化一般至少进行3~5次。克隆化有以下几种方法:
(一)有限稀释法 操作简单,出现率高,为实验室最常用的方法。
(二)显微操作法 直观可靠,但操作时间过长,容易增加污染机会。
(三)荧光激活细胞分选仪 先进、高效、高纯度、昂贵。
(四)软琼脂平板法 本法缺点是琼脂融化温度较难掌握,过高会导致细胞死亡,过低使细胞分布不均匀,操作较复杂,克隆出现率不稳定。
杂交瘤细胞应及时冻存,以保证细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。目前均采用液氮保存细胞。(注意逐步降温、快速复温)
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