2021临床检验技师考试《化学检验》知识点：血清酶催化活性浓度

第十五章　血清酶催化活性浓度和代谢物浓度检测技术

　　一、酶反应动力学原理（影响酶反应的因素）

　　酶反应动力学主要研究酶催化反应的过程与速率，以及各种影响酶催化速率的因素，定量时的观察对象是总单位时间内底物的减少或产物增加的量。

　　影响酶作用的因素包括底物的浓度、酶反应的最适pH、最适温度、酶的抑制作用，另外还包括试剂中表面活性剂的作用等因素。

　　1.底物浓度的影响

　　在检测试剂中底物浓度、辅因子、活化剂、复构剂的种类和浓度均对酶的测定至关重要。其中以底物的种类和浓度最为重要。

　　底物浓度影响遵循米氏方程：

　　ν=V[S]/Km+[S]

　　当底物浓度远远小于K _m ，增加底物浓度，反应速度增加。

　　当底物[S]＞＞K _m 时，公式近似为ν=V，反应速度不再增加，故此时反应速度为最大反应V。

　　从理论上说只有测定的是酶最大反应V，反应速度才和酶量成正比。

　　(1)底物的种类

　　若所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，K _m 最小的底物往往是此酶的生理底物。 (Km表示酶和底物的亲和力，Km越小亲和力越大)

　　如该酶测定主要用于临床诊断工作，首先应考虑有效诊断价值的底物。

　　选择Km小的底物测定酶活性，在最大反应速度时底物浓度也将最低。这意味着试剂成本可能较低，不易出现底物难溶解的困难。

　　(2)选择底物的合适浓度

　　确定底物种类后，重要的是选择底物的合适浓度。

　　米氏方程在选择酶测定底物浓度有着重要的指导作用。

　　计算出某一酶的Km后就可以计算出不同底物浓度和Km间的比值，将其代入米氏方程就可以计算出此时酶促反应速度相当于最大反应速度的百分比。

　　上述只能适应用于单一底物的酶。

　　2.反应体系的最适pH、缓冲液的种类和浓度

　　测定酶活性浓度时一定要选择在最适pH。

　　因为此处酶反应速度最大，测定灵敏度最高。此处酶活性变化的斜率最小，如反应体系中出现pH变化时，对测定结果影响最小。

　　pH还可以影响酶的稳定性。

　　为使反应体系能稳定在最适pH范围，实际检测时多采用不同类型、不同浓度的缓冲液。

　　3.温度的控制

　　温度对酶活性影响具有双重性。

　　化学速度随温度升高而加快，酶反应也不例外。

　　Q10值即温度增加10℃，化学速度的变化率。酶的Q10值约在1.5～2.5。(温度每增加10℃，酶促反应速度增加1～2倍左右。)

　　当温度超过一定范围，反应速度下降，(酶蛋白变性)应选最适反应温度。

　　37℃是目前使用最广泛的测定酶催化活性浓度的温度。

　　二、酶活性的定义及单位

　　酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。

　　表示常用国际单位。

　　国际单位定义表示酶量的多少，即1min能转化1微摩尔底物（μmol）的酶量为一个国际单位（μmol/min）。

　　用SI制表示的酶活性单位为Katal（催量）。

　　每秒钟转化1个摩尔底物的酶量为1Katal。

　　常用单位为μKatal或nKatal。

　　国际单位和Katal间关系为：

　　1U=1μmol/min=16.67nmol/s=16.67nKatal

　　1.连续监测法中酶活性浓度的计算

　　在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变 ，通过计算求出酶反应初速度的方法。

　　连续监测法优点之一是计算方便，不需作标准曲线或标准管，用分光光度计监测酶反应过程时，很容易求出反应体系中每分钟吸光度变化，根据摩尔吸光系数可求出△A(相当测定物质变化的微摩尔数)。

　　计算中要考虑标本的稀释倍数，还应考虑光径不同时对△A的影响。

　　ε为微摩尔(线性)吸光体系

　　△A为吸光度变化

　　ν为标本体积(ml)

　　V为反应体系体积(ml)

　　L为光径(cm)

　　后面几项皆为常数，叫做酶活力浓度测定转化因子：

　　2.常数K值设置

　　在测酶时，常数K值的选择是很重要的。

　　比值过高虽然测定的线性范围较宽，但重复性差。反之，虽然精密度好，但线性窄。

　　K值设置的首发点应是测定酶的判断值或参考值上限，应保证这些值测定的可靠。

　　3.临床酶催化活性浓度测定的校准

　　由于临床酶催化活性浓度测定受测定方法和条件的影响，国际医学检验量值溯源委员会推荐了常用酶测定的参考方法。采用与仪器和试剂相配套的有溯源校准的校正测定系统，是发展趋势。

　　三、测定酶活性浓度的两大类方法

　　1.固定时间法(取样法、终点法、两点法)

　　先让酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，然后停止酶反应，加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。

　　用这类方法测酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则将引起较大误差。

　　该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或产物的变化。

　　2.连续监测法(速率法)

　　连续监测法具有测定准确等众多的优点，随着科学技术的发展，自动生化仪的使用，正在逐步取代“固定时间法”。实际工作中，测酶活性浓度常用酶偶联法。

　　最简单的酶偶联反应为以下模式：

　　A：底物

　　B：待测酶产物(不能直接测定)

　　C：指示酶产物(可以直接测定)

　　Ex：待测酶

　　Ei：指示酶

　　如果一些酶反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，可以加入另一种酶，将两者连接起来，模式如下：

　　酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别是有一个明显的延滞期。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。

　　反应体系中不应有中间产物堆积，否则将导致误差。

　　四、代谢物浓度酶法测定

　　传统的代谢物酶法测定分为终点法和动力学法。

　　酶的作用有特异性，成分复杂的血清等体液样品往往不需进行预处理，简化了实验程序。

　　酶的本质是蛋白质，没有毒性，这样就避免了环境污染。酶促反应的条件温和，制成试剂盒可适用于自动分析。

　　1.代谢物酶促终点法测定

　　在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少，产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反应趋于平衡。

　　测定反应完全后（反应达到平衡时）待测物或产物变化的总量，即终点法，又称平衡法。

　　代谢物浓度酶促终点法测定的基本条件是：

　　①待测物浓度[S]应远小于其米氏常数K _m ，此时任何时刻的反应速度ν=V[S]/K _m ，呈一级反应动力学；

　　②反应配方中所用酶量应足够大，而Km应小，以保证有较快的反应速度完成测定。

　　(1)一步法

　　如果待测物与产物在理化性质上有便于检测的差异，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析，这种是最简单的底物法测定。

　　(2)酶促偶联法

　　如果酶促反应的底物或产物没有可直接检测的成分，则可将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，而达到检测的目的。

　　一般把第一步反应称为辅助反应，所用工具酶叫辅助酶，偶联的反应称为指示反应，指示反应所用的工具酶叫指示酶。

　　偶联反应应设计为非限速反应。

　　(3)最常用的偶联指示系统有两个

　　以脱氢酶为指示系统的酶促反应，不管是终点法测定，还是动力学法测定，共同的缺陷是受到内源性脱氢酶及其底物 如乳酸脱氢酶和乳酸/丙酮酸的干扰。

　　为了消除乳酸脱氢酶的干扰，在反应设计时一般采用加入乳酸脱氢酶的抑制剂的方法来解决。

　　终点法还受到乳糜、黄疸和溶血的影响，测定时需设定样品空白。

　　终点法实验设计应考虑的问题

　　①所用工具酶的特异性。

　　②酶对待测物的亲和力，在保证测定线性的前提下，Km要尽量小。

　　③酶的用量要足够大。

　　④工具酶中的杂酶应低于允许限。

　　⑤反应平衡点：应创造条件使反应朝正反应方向进行。

　　⑥试剂中的附加剂(如稳定剂、防腐剂、赋形剂)，不应抑制酶的活性。

　　2.动力学法测定

　　总单位时间内底物减少或产物增加的量。