2020临床检验技士《免疫检验》：免疫细胞的分离及其表面标志检测技术

　　第十四章　免疫细胞的分离及其表面标志检测技术

　　第一节　免疫细胞的分离

　　一、外周血单个核细胞的分离

　　外周血中单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的比重介于1.075～1.090 之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间，因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。

　　对分离介质的基本要求是：

　　①对细胞无毒;

　　②基本等渗;

　　③不溶于血浆及分离物质;

　　④有特定的比重。

　　Ficoll分离液 (2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液与1份34%泛影葡胺生理盐水溶液混合)为常规的淋巴细胞 分离液，其比重为1.077 ±0.002，主要用于分离外周血中单个核细胞。

　　密度梯度离心后其分布由上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。

　　二、淋巴细胞的分离

　　纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca ²⁺ 存在时，能主动黏附 在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。主要的方法有：

　　1.黏附贴壁法;

　　2.吸附柱过滤法;

　　3.磁铁吸引法;

　　4.Percoll分离液法。

　　三、T、B细胞和T细胞亚群的分离

　　(一)磁性微球分离法

　　(二)荧光激活细胞分离仪分离法

　　四、分离细胞的保存及活力测定

　　1.短期保存技术：将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清 的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。短期保存可置于4℃ 保存。

　　2.长期保存技术：液氮深低温(-196℃)环境保存细胞，加入二甲亚砜 作为保护剂。

　　活力测定最简便常用的为台盼蓝 染色法。这是一种阴离子型染料，不能透过活细胞 正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色 ，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。

　　第二节　淋巴细胞表面标志及亚群分类

　　常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志的是簇分化抗原(CD)。CD抗原的鉴定和检测依赖于其相应的单克隆抗体 。

　　一、T细胞表面标志及其亚群

　　(一)T细胞表面主要的CD抗原

　　1.CD2 ：表达于全部人T细胞和NK细胞表面，因其能与绵羊红细胞(SRBC)结合，又称为绵羊红细胞受体。

　　2.CD3：所有的T细胞均有共同的标志性抗原 ，是T细胞的表面标志，是TCR-CD3复合物的重要组成部分。

　　3.CD4/CD8 ：CD4和CD8分子是区分T细胞亚群的重要标志。表达CD4的主要是辅助性T细胞，表达CD8的主要是细胞毒性T细胞。

　　4.其他表面标志：致有丝分裂受体;病毒受体。

　　（二）T细胞亚群

　　1.辅助性T细胞 ：表面标志是CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD8 ^- 。主要有两种辅助性T细胞(Th1，Th2)。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等细胞因子辅助细胞免疫 或参与迟发型超敏反应 ，本身具有明显的细胞毒作用 ;Th2 主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等细胞因子辅助体液免疫 ，参与速发型超敏反应，但本身不具有明显的细胞毒作用。

　　2.细胞毒性T细胞：表面标志是CD3+CD4-CD8+。分泌细胞因子的特征与Th1和Th2十分相似，遂细分为Tc1与Tc2，Tc1与Tc2都有典型的细胞毒性效应。

　　3.调节性T细胞：主要包括两个亚群，一种是CD4+CD25+调节性T细胞;另一种为CD8+调节性T细胞，其主要包括CD8+CD28-调节性T细胞和CD8+CD28-限制性的调节性T细胞。

　　二、B细胞表面标志

　　B细胞→浆细胞→抗体，执行体液免疫功能。

　　膜免疫球蛋白(mIg)又称为BCR，表达于所有成熟的B细胞表面，是B细胞最具特性的表面标志 。mIg的主要作用是结合特异性抗原。成熟B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD。

　　B细胞及其亚群的检测是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫调节紊乱的重要指标。

　　三、NK细胞表面标志

　　目前NK标志以CD3-、CD16+、CD56+为公认。CD16分子又称为低亲和性IgG Fc受体，当IgG类抗体与靶细胞表面相应抗原表位特异性结合后，可通过其Fc段与NK细胞表面FcR Ⅲ 结合，行使产生NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC )。

　　第三节　其他免疫细胞

　　抗原提呈细胞(APC)指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞。分为两类：

　　①“专职” 抗原提呈细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞 ，它们均可表达MHC- Ⅱ类分子;

　　②“非专职”抗原提呈细胞，包括内皮细胞、上皮细胞和激活T细胞等，它们在某些因素刺激下可表达MHC-Ⅱ类分子，并具有抗原提呈功能。

　　一、单核-吞噬细胞系统

　　单核-吞噬细胞系统(MPS)包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞。单核-吞噬细胞的典型的表面标志是CD14 。

　　二、树突状细胞（DC）

　　根据刺激T细胞增殖能力 的不同，它们被分为成熟和不成熟的DC;根据诱导T细胞分化为不同效应T细胞的功能，将它们分为诱导分化Th1的DC(DC1)和诱导分化Th2的DC(DC2);根据明显的谱系和细胞表型的不同，分为骨髓DC和淋巴DC。

　　人成熟DC的主要特征表面标志为CD1a、CD11c和CD83，但不表达其他淋巴细胞的表面标志。

　　第四节　免疫细胞表面标志的检测及应用

　　一、免疫细胞表面标志的检测方法

　　采用标记单克隆抗体为探针，通过标志物对阳性细胞作出指示，对有关细胞进行计数，代表方法为：

　　(一)抗体致敏细胞花环法

　　(二)免疫细胞化学法：以酶作为抗体标志物，采用细胞酶免疫组织化学技术完成，并常采用生物素-链霉亲和素放大系统提高灵敏度。

　　（三）免疫荧光法 ：将分离得到的外周血单个核细胞与相应的以荧光素标记的CD单克隆抗体作用(直接法)，或与抗相应CD单克隆抗体作用后，洗去游离的抗体，再加入荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清(间接法)，制片后用荧光显微镜观察结果，计算阳性细胞占总计数细胞的百分率。

　　（四）流式细胞分析法：目前免疫细胞的检测主要采用流式细胞术 ，结果客观准确，重复性好。

　　二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义

　　淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。

　　在评价免疫功能时经常采用CD4/CD8 比值。

　　CD4/CD8升高常见于自身免疫性疾病;而CD4/CD8降低常见于病毒感染、恶性肿瘤和再生障碍性贫血等。

　　常采用淋巴细胞计数反映机体免疫状况。

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