2020临床医学检验技士考试《免疫检验》第十二章：固相膜免疫测定

第十二章　固相膜免疫测定

　　第一节　概述

　　固相膜免疫测定以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性、非共价键高度吸附抗体或抗原和易于漂洗等，固相膜像滤纸一样，可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行。标记物可用酶或各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金或胶体硒等。

　　一、常用的固相膜

　　固相膜免疫测定中常用的膜为硝酸纤维素(NC)膜以及玻璃纤维素(fiberglass)膜、尼龙(nylon)膜、聚偏氟乙烯(PVDF)膜等。其中最常用为NC膜。

　　二、固相膜的技术要求

　　1.孔径：用于穿流法的膜一般选择0.4μm左右，用于横流法的膜可选择5～10μm。

　　2.流速：孔径大，流速快。

　　3.蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示。

　　4.均一性：优质的膜应具有良好的均一性，这样才能保证试剂批内的均一性。

　　第二节　免疫金标记技术

　　利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标志物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色(IGSS)。

　　一、胶体金的制备

　　(一)制备原理：一般采用还原法，常用的还原剂有枸橼酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等。向金溶液内加入还原剂，使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶。

　　(二)技术要点：金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或免疫凝集试验的基础。

　　(三)注意事项

　　1.玻璃容器的清洁：玻璃表面污染会干扰胶体金颗粒的生成，用前经过强酸洗，后硅化。

　　2.试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其1%水溶液在4℃可稳定数月不变，实验用水一般用双蒸馏水，实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。

　　二、免疫金制备

　　(一)制备原理：蛋白质被吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程。

　　(二)技术要点

　　1.胶体金溶液的pH：原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。

　　2.蛋白质最适标记量

　　(三)注意事项

　　多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：

　　①为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存;

　　②为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。

　　第三节　膜载体免疫测定的种类与原理

　　一、斑点免疫渗滤试验(IFA)

　　用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标记物等，以及用于检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试剂。

　　(一)原理：将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，将膜贴于吸水材料上，依次在膜上滴加标本、免疫胶体金及洗涤液等试剂进行抗体或抗原反应，过量试剂很快渗入吸水材料中。

　　抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目的，同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到彻底洗涤的目的，简化了操作步骤。

　　(二)方法类型

　　1.双抗体夹心法测抗原：用抗体结合在微孔滤膜中央，滴加待检标本，抗原抗体反应后，滴加金标抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点。

　　2.间接法测特异性抗体：用抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测标本，滴加洗涤液洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点。该法由于血清标本中非目的IgG的干扰，易导致假阳性结果。

　　二、斑点免疫层析试验

　　(一)原理：免疫层析试验的原理与免疫渗滤相同，不同点在于液体的移动不是通过直向的穿流，而是基于层析作用的横流。在一塑料片条上依次粘贴如下组分：

　　①吸水纸;

　　②玻璃纤维膜，膜上固定着干燥的金标抗体;

　　③硝酸纤维素膜，膜上包被着线条状的抗体;

　　④吸水纸。

　　(二)方法类型：多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。常见方法类型有：

　　1.双抗体夹心法测抗原

　　2.竞争法测小分子抗原

　　3.间接法测抗体：为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法。

　　(三)技术要点

　　1.在5～20分钟内观察结果。

　　2.结果判断：阴性为出现1条棕红线质控条带;阳性为出现2条棕红线条带;无棕红线条带出现为试剂失效。

　　(四)临床应用

　　该技术不能准确定量，只能作为定性或半定量试验。

　　目前主要应用于正常体液中不存在的物质(如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等)和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质(如HCG等)的检测。

　　三、斑点酶免疫吸附试验

　　加少量抗原于硝酸纤维素(NC)膜上，干燥后进行封闭;然后滴加样品血清;洗涤后再滴加酶标二抗，最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液(如HRP标志物，常用二氨基联苯胺);阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点。

　　优点：灵敏度较普通ELISA高，试剂用量少，操作简单，NC膜可长期保存不影响活性。

　　四、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)

　　(一)原理：细胞受到刺激后局部产生细胞因子，被PVDF膜上特异性单克隆抗体捕获。细胞分解后，再与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF膜出现“紫色”的斑点为阳性反应。

　　(二)ELISPOT与ELISA的区别

　　1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

　　2.ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下或通过仪器对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。

　　3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万～30万个细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。

　　4.捕获抗体为高亲和力、高特异性和低内毒素McAb，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

　　五、免疫印迹法(IBT)

　　又称Western-blot，将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的高特异性相结合。

　　第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带)。

　　第二阶段为电转移。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

　　第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体(常为多克隆抗体)和酶标第二抗体作用后，加入底物，使区带染色。

　　常用的HRP底物为3，3-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色)。阳性反应的条带清晰可辨。并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。

　　六、放射免疫沉淀试验(RIPA)

　　以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，同时弥补了免疫印迹法的不足。

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