2019年<临床检验初级检验技师考试>第十六章第二节免疫测定方法

　　第二节免疫测定方法

　　一、ELISA方法

　　双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法。

　　细胞因子测定的标本主要包括两大类，一是血清(血浆)、关节液 、胸腔液 、脑脊液或腹腔液等体液，可用于细胞因子和可溶性黏附分子的检测;二是细胞体外培养后的培养上清液，只用于细胞因子的检测。

　　二、流式细胞分析法

　　流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。

　　该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或黏附因子的检测，精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况。

　　根据荧光抗体的性质，荧光抗体染色分直接法和间接法，前者使用荧光标记的细胞因子或黏附分子的特异性抗体，后者则用荧光标记二抗。直接法较为常用，其敏感性虽不及间接法，但特异性强。

　　该法检测细胞内细胞因子时，主要包括以下基本步骤：

　　1.分离和培养待检细胞。

　　2.细胞固定　常用的细胞固定剂为4%多聚甲醛。

　　3.封闭非特异性结合位点　即用含5%脱脂奶粉和钙、镁离子的PBS溶液，重悬已固定的细胞。

　　4.染色与分析　即用荧光素标记的细胞因子特异性单克隆抗体做荧光抗体染色，用流式细胞仪分析荧光阳性细胞百分比和荧光强度。此外，若应用不同荧光素标记两种以上细胞因子的单克隆抗体，则可同时检测同一细胞内2种以上不同的细胞因子。

　　应用此法还可区分具有不同分泌特性的细胞亚群，如Th1、Th2细胞等。

　　三、酶联免疫斑点试验

　　酶联免疫斑点试验(ELISPOT)，源自ELISA，但又突破传统ELISA，是定量测定抗体形成细胞技术的延伸和发展，已被愈来愈多地应用于类风湿因子、IFNγ等细胞因子分泌细胞的定量测定。

　　其基本原理是：在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，在有或无刺激物存在的条件下培养后，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。

　　细胞因子或其他可溶性分子分泌细胞的检测方法，能从20万～30万个细胞中检测出1个分泌相应分子的细胞。

　　四、免疫学测定方法学评价

　　①特异性高，使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测。

　　②操作简便、快速，无需依赖细胞株，故不需维持培养，使方法的可操作性大大增加，容易推广和便于普查。

　　③影响因素相对较少且容易控制，重复性好，方法容易标准化。

　　优点：

　　①所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定成正比。

　　②测定结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系，使用不同来源亲和力的单抗，对同一标本测到的结果可能不同。

　　缺点：

　　③敏感性相对较低，比生物活性法约低10～100倍，测定下限一般为100pg。

　　④若标本中存在细胞因子的可溶性受体，可能会影响特异性抗体对细胞因子的结合。